PBMC分离、培养、冻存与复苏全流程指南

外周血单个核细胞（PBMC）是免疫学研究和细胞治疗领域的重要细胞类型，广泛应用于免疫细胞功能分析、疫苗开发和细胞治疗等研究。本文将详细介绍PBMC的分离、培养、冻存和复苏全流程。

（一）分离原理

PBMC主要包括淋巴细胞（T细胞、B细胞和NK细胞）和单核细胞，这些细胞的密度低于红细胞和血小板。通过密度梯度离心法，可以将PBMC从全血中分离出来。

（二）分离步骤

1. 全血混匀：将采集的外周血轻轻混匀，避免剧烈震荡。

2. 准备分离介质：在离心管底部加入适量的分离介质（如Ficoll-Paque），通常为全血体积的1/2到2/3。

3. 加入全血：将全血小心地分层加入分离介质上方，避免扰动底层的分离介质。

4. 离心：将离心管放入离心机，以约560g的离心力离心20-30分钟。

5. 分层与提取：离心后，离心管中会出现分层，中间层为PBMC。小心地用移液器吸取PBMC层，避免上下层液体混杂。

6. 洗涤细胞：将提取的PBMC转移到新的离心管中，加入适量的生理盐水或DPBS，轻轻混匀后离心，去除残留的分离介质。

7. 重悬细胞：用适当的培养基或缓冲液重悬细胞，准备进行后续实验。

（一）培养条件

1. 培养基：常用RPMI 1640培养基，添加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（如青霉素/链霉素）。

2. 培养环境：37℃，5% CO₂，饱和湿度的细胞培养箱。

3. 细胞密度：建议初始细胞密度为1×10⁶ cells/mL。

（二）培养步骤

1. 细胞接种：将分离后的PBMC细胞以适当的密度接种到培养瓶或培养板中。

2. 观察细胞：次日更换培养液，观察细胞生长状态，确保细胞活性良好。

3. 定期换液：根据细胞生长情况，每2-3天更换一次培养液。

3. 直接冻存：将冻存管直接置于-80℃冰箱中过夜，次日可转移至液氮中长期保存。

上海微特森生物科技有限公司推出的免疫细胞专用冻存液，专为PBMC等免疫细胞设计，能够有效解决传统冻存方法的局限性，显著提高冻存效果。

1. 高细胞存活率

微特森冻存液采用优化配方，包含多种细胞保护剂，能够有效降低细胞在冻存过程中的损伤。其独特的保护机制包括细胞内外双重保护：保护剂成分能够穿透细胞膜，减少细胞内冰晶的形成，同时在细胞外结合水分子，降低电解质浓度，避免细胞膜损伤。实验数据表明，使用微特森冻存液冻存的免疫细胞复苏后存活率可达95%以上。

2. 简化冻存程序

与传统冻存方法相比，微特森冻存液无需复杂的程序降温步骤。用户只需将细胞重悬于冻存液中，直接置于-80℃冰箱中过夜，次日即可转移至液氮中长期保存。这种简化操作不仅节省了时间和精力，还减少了因操作不当导致的细胞损伤风险。

传统DMSO细胞冻存液与微特森无血清细胞冻存液冻存效果对比  

传统DMSO冻存液、免疫细胞专用无血清细胞冻存液(A405)和无血清细胞冻存液(A401)冻存人PBMC细胞，-80℃冻存后1个月-12个月后，复苏24小时检测细胞活率。

1. 准备材料：预热细胞培养基（如RPMI 1640，含10% FBS和1%抗生素），准备无菌离心管、移液器和37℃水浴锅。

2. 快速解冻：从液氮罐或-80℃冰箱中取出冻存管，迅速浸入37℃水浴锅中，轻轻摇动冻存管，使其快速融化。

3. 重悬细胞：将冻存管中的细胞悬液转移到离心管中，加入适量的预热培养基，轻轻混匀。

4. 离心洗涤：以300 x g的速度离心10分钟，弃去上清液，用培养基重悬细胞。

5. 细胞培养：将细胞转移到培养瓶中，加入适量的完全培养基，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

6. 观察细胞：次日更换培养液，观察细胞生长状态，确保细胞活性良好。